EZ 640 TUNEL細(xi)胞凋亡(wang)檢測試(shi)劑(ji)盒（遠(yuan)紅熒(ying)光(guang)）

產品描述(shu)

細(xi)胞凋(diao)亡的一(yi)個(ge)顯著(zhu)特點是細(xi)胞染色體(ti) DNA 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)降解(jie)，這(zhe)是一(yi)個較普遍(bian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)現(xian)象。這(zhe)種降解(jie)非(fei)常特(te)異(yi)并(bing)有規律，所產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不同長(chang)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)整數倍，表現(xian)為瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電泳中呈現(xian)特(te)異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)梯狀 Ladder 圖(tu)譜，本(ben)試劑(ji)盒采用(yong) TUNEL 法，應(ying)用(yong)末(mo)端脫氧核糖(tang)核苷酸轉移酶(mei)(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡(wang)細胞(bao)斷裂(lie)DNA 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3′-OH 末(mo)端催化(hua)摻入EZ 640-dUTP。 EZ 640-dUTP標記(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 可以(yi)用(yong)熒光顯微鏡直接觀察或(huo)者用(yong)流式細胞(bao)儀定量。 TUNEL法可以(yi)選擇性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測凋亡(wang)細胞(bao)， 而非(fei)壞死細胞(bao)或(huo)因(yin)輻照和藥物治療而造成的(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 鏈斷裂(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)。TUNEL 實驗(yan)中， TdT 酶(mei)催化(hua) dUTP 摻入斷裂(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)(de)(de)(de)(de)3′-OH末(mo)端。抗(kang)原標記(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de) dUTP（如(ru)digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因為(wei)它(ta)可以直接進行(xing)原位檢測，是一(yi)種更快(kuai)速(su)、直接的檢測手段。

訂購信息

產品組分

運輸與保(bao)存

藍冰運輸(shu)。-20℃避光保存(cun)，有效期24個(ge)月。【注】：避免反復凍(dong)融。

實(shi)驗材(cai)料（自備）

PBS緩(huan)沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）

4%多**醛（PBS配制）

免(mian)疫組化筆

脫(tuo)蠟溶劑（石(shi)蠟切片樣本）

石蠟切片(pian)處理(li)相(xiang)關試劑(ji)

抗熒光淬(cui)滅封片(pian)劑(ji)

ddH₂O

使用方(fang)法

一、實驗設計

1. 陽性對(dui)照（可選）：

　　DNase I處理(li)制備陽性對照載玻片(pian)。DNase I可以消(xiao)化單鏈(lian)或(huo)(huo)雙鏈(lian)DNA產生單脫(tuo)(tuo)氧(yang)核苷酸(suan)或(huo)(huo)單鏈(lian)或(huo)(huo)雙鏈(lian)的寡(gua)脫(tuo)(tuo)氧(yang)核苷酸(suan)的核酸(suan)內切酶，人(ren)為造成細胞凋亡。

2. 陰(yin)性對照（可(ke)選）：

　　使用(yong)不(bu)含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代(dai)TdT Enzyme。

3. 實驗處理組。

4. 實驗對照組。

二、實驗(yan)步驟

1. 樣本準備：

對(dui)于貼壁細(xi)胞或細(xi)胞涂片

（1）PBS清洗1次。【注】：如果擔(dan)心細(xi)胞(bao)涂片的細(xi)胞(bao)貼(tie)得(de)不牢(lao)，可(ke)以干燥樣品使(shi)細(xi)胞(bao)貼(tie)得(de)更牢(lao)。

（2）固定：加(jia)入適(shi)量4%多(duo)**醛（PBS配制），室溫(wen)固定30 min。PBS清(qing)洗2次。

（3）通透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清(qing)洗2次。

（4）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應。

對于懸浮細(xi)胞或細(xi)胞懸液

（1）收集(ji)細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（2）固(gu)定：加入適量4%多(duo)**醛(quan)（PBS配制）充分(fen)重懸(xuan)細(xi)胞，4℃固(gu)定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗(xi)2次。

（3）通(tong)透：加入適(shi)量(liang)0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫(wen)通透20 min。2000 rpm離(li)心(xin)5 min，PBS清洗2次。

（4）轉(zhuan)步驟2. TUNEL 反(fan)應(ying)。

石蠟(la)組織切片

（1）脫蠟(la)與水(shui)化：將切(qie)片樣(yang)本依次放入二甲苯I（10 min）→ 二甲苯(ben)II（10 min）→ 100％乙醇(chun)(chun)I（5 min）→ 100％乙醇(chun)(chun)II（5 min）→ 95%乙醇(chun)(chun)（5 min）→ 90%乙醇(chun)(chun)（5 min）→ 80%乙醇(chun)(chun)（5 min）→ 70%乙醇(chun)(chun)（5 min）→ ddH2O沖(chong)洗5 min，沖(chong)洗2次(ci)。【注】：二甲苯(ben)有毒(du)，易揮發，請(qing)在通(tong)風櫥中(zhong)進(jin)行此操作。

（2）用(yong)濾紙(zhi)吸干切片(pian)樣本(ben)(ben)周圍液體(ti)，用(yong)免(mian)疫(yi)組化(hua)筆圈(quan)好樣本(ben)(ben)輪廓，以便(bian)下游通透與標記。

注：若在(zai)后(hou)續實驗操作中發現免(mian)疫(yi)組化筆畫的(de)輪廓圈被破壞，需及時補畫。

（3）通透：按1: 100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液(ye)用PBS稀(xi)釋(shi)至終濃度20 µg/mL，在每個樣本(ben)上滴加(jia)100 µL，使溶液(ye)覆蓋全部(bu)樣本(ben)區域，20-37℃孵(fu)育20 min。【注】：Proteinase K可通透(tou)細(xi)胞膜和核(he)膜，從(cong)而使后(hou)續步驟的染色試(shi)劑充(chong)分進(jin)入細(xi)胞核(he)進(jin)行反(fan)應，提(ti)高(gao)標記效率(lv)。孵(fu)育時間過(guo)長會(hui)增(zeng)加組織(zhi)切片(pian)在后(hou)續洗(xi)滌步驟中(zhong)從(cong)載波片(pian)上脫落的風險，過(guo)短則可能(neng)造成透(tou)性處理不充(chong)分，影(ying)響(xiang)標記效率(lv)。為得到更好的結果，Proteinase K的濃度、孵(fu)育時間、溫度需根據不同(tong)類型(xing)組織(zhi)樣本(ben)進(jin)行優(you)化。

（4）PBS漂洗切片2次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)5 min，用濾紙吸去多(duo)余(yu)的(de)液(ye)體，將處理好的(de)樣本放在濕盒中保(bao)持(chi)濕潤。

注：這(zhe)一(yi)步必須把Proteinase K洗滌干(gan)凈，否則會嚴重干(gan)擾后續的標記(ji)反應。

（5）轉步(bu)驟(zou)2. TUNEL 反應。

冰(bing)凍組織(zhi)切片(pian)

（1）固定：取出冰凍切(qie)片，并回溫(wen)至室(shi)溫(wen)。加(jia)入適量4%多**醛（PBS配制），室溫固定30 min。PBS漂洗2次(ci)，每次(ci)10 min。【注】：若是擔心甲醛清洗不干凈，影響最(zui)終染(ran)色(se)效果(guo)。可(ke)在甲醛固定完成后(hou)加(jia)入適量2 mg/mL 甘*酸清洗 10 min，中和殘留的固定液，再進行(xing)PBS清洗。

（2）用濾紙吸干切片樣(yang)本周圍液體，用免疫組化筆(bi)圈好樣(yang)本輪廓，以(yi)便下(xia)游通透與(yu)標(biao)記。

注：若(ruo)在后續實驗操作中發現免疫(yi)組(zu)化筆畫的輪廓圈被破(po)壞，需及時補(bu)畫。

（3）通透：按1: 100的比例(li)，將(jiang)2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀(xi)釋至終濃度(du)20 µg/mL，在每個樣(yang)本(ben)上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣(yang)本(ben)區域，20-37℃孵(fu)育20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞(bao)膜(mo)和核(he)(he)膜(mo)，從(cong)而(er)使后續(xu)步驟的(de)染色(se)試劑充分進入(ru)細胞(bao)核(he)(he)進行反(fan)應，提(ti)高(gao)標記效率。孵育(yu)時(shi)間過長(chang)會增加組織切片在后續(xu)洗滌(di)步驟中從(cong)載波片上(shang)脫落的(de)風險，過短則(ze)可能造(zao)成透性處理不充分，影響標記效率。為(wei)得(de)到更好的(de)結果(guo)，Proteinase K的(de)濃度(du)、孵育(yu)時(shi)間、溫(wen)度(du)需根據不同類型組織樣本進行優化。

（4）PBS漂洗切片2次(ci)，每次(ci)5 min，用濾紙(zhi)吸去多余的液(ye)體，將處理好的樣本(ben)放在濕(shi)盒中保(bao)持濕(shi)潤。【注】：這一步必須(xu)把Proteinase K洗滌干(gan)凈，否(fou)則(ze)會嚴(yan)重干(gan)擾后續的標(biao)記反(fan)應。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應。

陽性(xing)(xing)處理（僅陽性(xing)(xing)對照進行此(ci)步驟，其他樣品直(zhi)接進行TUNEL反應(ying)步驟）

（1）按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備(bei)用。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已處(chu)理的樣本(ben)上，覆蓋全部樣本(ben)區(qu)域(yu)，室溫平衡(heng)5 min。

（3）用(yong)1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作(zuo)液(ye)。

（4）棄(qi)去Buffer，加(jia)入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵(fu)育10 min。

（5）棄(qi)去DNase I工作液，PBS清洗2次(ci)。

（6）轉步(bu)驟2. TUNEL 反應。

2. TUNEL 反(fan)應

配(pei)制TUNEL反應液（即用即配）：

對于(yu)貼(tie)壁細胞、細胞涂片或(huo)組織(zhi)切片

（1）每個樣本加入50 μL TUNEL反(fan)應液，使反(fan)應液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵(fu)育適宜的(de)時間（細胞推薦染(ran)色(se)時間30min-1h，組(zu)織(zhi)染(ran)色(se)時間推薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)應液(ye)(ye)適合涂片(pian)、切片(pian)或(huo)96孔板（其他不同孔板可(ke)以適當(dang)調整TUNEL反(fan)應液(ye)(ye)體(ti)積，覆蓋(gai)(gai)細胞即(ji)可(ke)）。如(ru)果待檢(jian)測的樣(yang)(yang)品為涂片(pian)、切片(pian)或(huo)在(zai)24孔板、12孔板或(huo)6孔板中(zhong)，可(ke)以使(shi)用防蒸(zheng)發膜，或(huo)自行嘗試使(shi)用自封(feng)袋或(huo)者(zhe)其它適當(dang)材料自行裁(cai)剪成(cheng)比孔略小的圓形塑料片(pian)，滴加TUNEL反(fan)應液(ye)(ye)后覆蓋(gai)(gai)在(zai)樣(yang)(yang)品上(shang)，可(ke)以防止(zhi)TUNEL反(fan)應液(ye)(ye)蒸(zheng)發，并且使(shi)TUNEL反(fan)應液(ye)(ye)均勻覆蓋(gai)(gai)樣(yang)(yang)本。

（2）棄去(qu)TUNEL 反應液，PBS漂洗2次，每次5 min。【注】：為了(le)降低背(bei)景(jing)，PBS漂洗切片1次后，可再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）漂洗3次，每次 5 min，這樣(yang)游(you)離(li)的未反應的標記物可以清除較干凈(jing)。

（3）（可選）每(mei)個(ge)樣本加入適量濃度為5 μg/mL 的(de)DAPI染液，室溫避光孵育5 min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS漂洗2次，每次5 min。

（4）（可選）切(qie)片(pian)封片(pian)：將切(qie)片(pian)依次(ci)在純水、70%乙(yi)醇(chun)、80%乙(yi)醇(chun)、90%乙(yi)醇(chun)、95%乙(yi)醇(chun)、無水(shui)乙(yi)醇(chun)中(zhong)浸沒(mei)5 min，最后將切片(pian)(pian)(pian)(pian)樣本置于染色缸中(zhong)以(yi)新鮮的(de)二甲苯(ben)浸泡(pao)，透明化處理2次，每(mei)次5 min。脫水(shui)完成(cheng)后，擦去切片(pian)(pian)(pian)(pian)周圍的(de)液(ye)體，每(mei)個樣本滴(di)加50 μL抗(kang)熒光(guang)淬滅封(feng)片(pian)(pian)(pian)(pian)劑(ji)（抗(kang)熒光(guang)淬滅封(feng)片(pian)(pian)(pian)(pian)劑(ji)可能(neng)會不適用于某些染料，實驗(yan)前建(jian)議進行(xing)預實驗(yan)測試匹配性），蓋(gai)上蓋(gai)玻片(pian)(pian)(pian)(pian)，用鑷(nie)子的(de)鈍端(duan)輕輕敲擊蓋(gai)玻片(pian)(pian)(pian)(pian)，去除氣泡(pao)以(yi)使封(feng)片(pian)(pian)(pian)(pian)。

（5）用濾紙吸(xi)去多余的液體(ti)，向樣(yang)本區(qu)域加100 μL PBS保持樣(yang)本濕潤(run)，立即(ji)在熒光(guang)顯微鏡下(xia)觀察(cha)。

對于懸浮細(xi)胞或細(xi)胞懸液

（1）每個樣本管加入50 μL TUNEL反應液輕輕重懸細胞，37℃避光(guang)孵育30~60 min。每隔15 min用(yong)微量(liang)移液器輕輕重懸細胞。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄(qi)去TUNEL 反應液(ye)，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）輕(qing)輕(qing)重懸細胞(bao)，并清洗2次。

（3）每個樣(yang)本管加入(ru)100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵(fu)育5 min。

（4）加入400 μL PBS重懸細胞(bao)，立即用流式細胞(bao)儀檢測或(huo)進行涂片(pian)后在熒光顯(xian)微鏡下觀察。

注意事項(xiang)

1. 本產品(pin)僅(jin)限于(yu)科學實驗研(yan)究使用，不得用于(yu)臨床診斷、治療等(deng)領域。

2. 使用(yong)前(qian)請將產品瞬時(shi)離(li)心至管底，再進行后(hou)續實驗。

3. 染色(se)背景較重或(huo)非特異性(xing)著色(se)明(ming)顯時可(ke)適當減少染色(se)時間。

4. 實驗(yan)時(shi)建議增加陰性對(dui)照和陽(yang)性對(dui)照組。

5. 組分A使用(yong)時請(qing)佩戴口罩、手套(tao)，如接觸皮膚，請(qing)立(li)即用(yong)大量水沖洗。

6. 熒(ying)(ying)光染料(liao)均存在淬(cui)滅(mie)問題(ti)，請盡量注意(yi)避光，以(yi)減(jian)緩熒(ying)(ying)光淬(cui)滅(mie)。

7. 為了您的安(an)全(quan)和健康，請穿實驗服并戴一(yi)次性(xing)手套操作(zuo)。

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