EZ 555 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（橙(cheng)紅熒光）

產(chan)品(pin)描述

細胞凋亡的(de)一(yi)個(ge)顯著特(te)點是細胞染(ran)色體(ti) DNA 的(de)(de)降(jiang)解，這是一(yi)個較(jiao)普遍的(de)(de)現象。這種降(jiang)解非(fei)(fei)常特異并(bing)有規律，所產生的(de)(de)不同長(chang)度的(de)(de) DNA 片(pian)段約為(wei) 180 bp-200 bp 的(de)(de)整數倍(bei)，表現為(wei)瓊脂(zhi)糖凝膠電泳中呈(cheng)現特異的(de)(de)梯狀 Ladder 圖譜，本試劑盒采用(yong) TUNEL 法(fa)，應用(yong)末(mo)端脫氧核糖核苷酸轉(zhuan)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡(wang)細胞(bao)(bao)斷(duan)裂(lie)DNA 的(de)(de)3′-OH 末(mo)端催化摻入EZ 555-dUTP。EZ 555-dUTP標記的(de)(de) DNA 可(ke)以用(yong)熒(ying)光顯微(wei)鏡直(zhi)接觀察或者用(yong)流式細胞(bao)(bao)儀定量。 TUNEL法(fa)可(ke)以選擇性的(de)(de)檢測凋亡(wang)細胞(bao)(bao)，而(er)非(fei)(fei)壞死(si)細胞(bao)(bao)或因輻(fu)照和藥物(wu)治療而(er)造成(cheng)的(de)(de) DNA 鏈斷(duan)裂(lie)的(de)(de)細胞(bao)(bao)。TUNEL 實驗中， TdT 酶催化 dUTP 摻入斷(duan)裂(lie)的(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)3′-OH末(mo)端。抗原標記的(de)(de) dUTP（如(ru)digoxin-dUTP、生(sheng)*素(su)-dUTP），因為它可(ke)以直(zhi)接進行原(yuan)位檢(jian)(jian)測(ce)，是一種更快速、直(zhi)接的(de)檢(jian)(jian)測(ce)手段。

訂購信息

產品組分

運輸與(yu)保存(cun)

藍冰運輸。-20℃避(bi)光保存，有效期24個月。【注】：避免反復凍融。

實驗(yan)材料（自備）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配(pei)制）

0.1% Triton X-100（PBS配制，其(qi)中(zhong)含5 mg/mL BSA）

4%多**醛（PBS配(pei)制）

免(mian)疫組化筆

脫蠟溶劑（石(shi)蠟切片樣本）

石蠟切片處(chu)理相關試(shi)劑

抗(kang)熒光(guang)淬滅封片劑

ddH₂O

使用方法

一、實驗設計

1. 陽性對照（可(ke)選）：

　　DNase I處理制備陽性對照(zhao)載玻片。DNase I可(ke)以消化(hua)單(dan)(dan)鏈(lian)或雙鏈(lian)DNA產生單(dan)(dan)脫(tuo)氧核(he)苷(gan)酸或單(dan)(dan)鏈(lian)或雙鏈(lian)的(de)寡脫(tuo)氧核(he)苷(gan)酸的(de)核(he)酸內切酶(mei)，人為造成細(xi)胞(bao)凋亡。

2. 陰性對照（可選）：

　　使用(yong)不(bu)含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用(yong)ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處(chu)理組(zu)。

4. 實驗對照(zhao)組(zu)。

二(er)、實(shi)驗(yan)步驟(zou)

1. 樣本準(zhun)備：

對于貼壁細胞或(huo)細胞涂片(pian)

（1）PBS清洗(xi)1次(ci)。【注】：如果擔心(xin)細(xi)(xi)胞涂片(pian)的細(xi)(xi)胞貼(tie)(tie)得不牢(lao)，可以(yi)干燥樣品使細(xi)(xi)胞貼(tie)(tie)得更(geng)牢(lao)。

（2）固定：加入(ru)適(shi)量4%多**醛（PBS配(pei)制），室溫(wen)固定30 min。PBS清洗2次。

（3）通透：加入適量0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通透(tou)20 min。PBS清洗2次(ci)。

（4）轉(zhuan)步驟2. TUNEL 反應。

對于懸浮細胞(bao)或(huo)細胞(bao)懸液

（1）收集細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗(xi)2次(ci)。

（2）固定：加入適量(liang)4%多**醛（PBS配制）充分(fen)重(zhong)懸細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心(xin)5 min，PBS清(qing)洗2次(ci)。

（3）通透：加入適量(liang)0.2% Triton X-100（PBS配制），室溫通(tong)透20 min。2000 rpm離心(xin)5 min，PBS清洗2次。

（4）轉步驟(zou)2. TUNEL 反(fan)應。

石蠟(la)組織切片

（1）脫蠟與(yu)水化：將(jiang)切片樣本依次(ci)放(fang)入(ru)二甲苯I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇I（5 min）→ 100％乙(yi)(yi)醇II（5 min）→ 95%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ 90%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ 80%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ 70%乙(yi)(yi)醇（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。【注】：二甲(jia)苯(ben)有(you)毒(du)，易揮發，請在(zai)通(tong)風(feng)櫥中進行此操(cao)作(zuo)。

（2）用濾紙吸干(gan)切片樣(yang)本周(zhou)圍液體，用免疫組化筆圈好樣(yang)本輪廓(kuo)，以便下(xia)游通透與標記(ji)。

注：若(ruo)在后續實驗操作(zuo)中(zhong)發現免疫組化筆(bi)畫的輪廓圈被破壞(huai)，需及時(shi)補畫。

（3）通透：按(an)1: 100的(de)比例，將2 mg/mL的(de)Proteinase K溶液用(yong)PBS稀(xi)釋(shi)至終濃度20 µg/mL，在(zai)每個樣本(ben)上滴加100 µL，使溶液覆蓋(gai)全部樣本(ben)區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可(ke)通透細胞(bao)膜和核膜，從而使后續步(bu)驟的(de)(de)染(ran)色試劑充(chong)分進(jin)入細胞(bao)核進(jin)行反(fan)應，提高標記(ji)效(xiao)率。孵育時(shi)(shi)間過長會增加組織切片在后續洗滌步(bu)驟中從載波片上脫(tuo)落的(de)(de)風(feng)險，過短則(ze)可(ke)能造成(cheng)透性處理不充(chong)分，影響標記(ji)效(xiao)率。為得到更(geng)好的(de)(de)結果，Proteinase K的(de)(de)濃度(du)、孵育時(shi)(shi)間、溫度(du)需根據(ju)不同類(lei)型組織樣本進(jin)行優化(hua)。

（4）PBS漂洗切片2次，每次5 min，用(yong)濾紙吸去多余(yu)的(de)液體，將(jiang)處理(li)好的(de)樣本(ben)放在濕盒中保持濕潤(run)。

注：這(zhe)一步必(bi)須把Proteinase K洗滌干凈，否則會嚴重(zhong)干擾后續(xu)的標記反應。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應。

冰凍組織切片

（1）固(gu)定(ding)：取出(chu)冰(bing)凍(dong)切(qie)片，并回(hui)溫至室溫。加(jia)入適量4%多**醛（PBS配制），室溫固定30 min。PBS漂洗2次，每次10 min。【注】：若是擔心甲醛清洗(xi)不干(gan)凈，影響最(zui)終染色效果。可在甲醛固定完成后加入適量2 mg/mL 甘(gan)*酸清(qing)洗 10 min，中和殘留(liu)的(de)固定液，再進行PBS清(qing)洗(xi)。

（2）用濾紙吸干切片樣(yang)本周圍液體，用免疫組(zu)化筆圈好樣(yang)本輪(lun)廓，以便(bian)下游(you)通透與標(biao)記。

注(zhu)：若在后續實驗操作中發(fa)現免疫組化筆畫的(de)輪廓圈被破壞，需(xu)及時補畫。

（3）通(tong)透：按1: 100的(de)比例，將2 mg/mL的(de)Proteinase K溶(rong)(rong)液用PBS稀釋至終濃度(du)20 µg/mL，在每個樣(yang)本上(shang)滴加100 µL，使溶(rong)(rong)液覆(fu)蓋全部樣(yang)本區域，20-37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可(ke)通透細胞膜和核膜，從而使(shi)后續(xu)步(bu)(bu)驟(zou)的染色試劑(ji)充分進(jin)(jin)(jin)入細胞核進(jin)(jin)(jin)行反應，提高(gao)標記(ji)效率。孵(fu)育時(shi)(shi)間過長會增加(jia)組(zu)織切片在后續(xu)洗(xi)滌步(bu)(bu)驟(zou)中(zhong)從載(zai)波片上脫落的風險，過短(duan)則可(ke)能造成透性處理(li)不充分，影響(xiang)標記(ji)效率。為(wei)得到(dao)更好的結果，Proteinase K的濃度、孵(fu)育時(shi)(shi)間、溫度需根(gen)據(ju)不同(tong)類型(xing)組(zu)織樣本(ben)進(jin)(jin)(jin)行優化。

（4）PBS漂洗(xi)切片2次(ci)，每次(ci)5 min，用濾紙吸去多(duo)余的液體，將處理好的樣(yang)本放(fang)在濕盒(he)中保持濕潤。【注】：這一(yi)步必(bi)須把Proteinase K洗滌(di)干(gan)凈，否則會嚴重(zhong)干(gan)擾后(hou)續的標記反應。

（5）轉(zhuan)步驟2. TUNEL 反應。

陽性(xing)處(chu)理（僅陽性(xing)對照進行此(ci)步驟(zou)，其(qi)他樣品直(zhi)接進行TUNEL反(fan)應(ying)步驟）

（1）按1: 10的(de)比例用(yong)ddH2O將10× DNase I Buffer稀(xi)釋(shi)成1× DNase I Buffer備(bei)用(yong)。

（2）滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已處(chu)理的樣(yang)(yang)本上，覆蓋(gai)全部樣(yang)(yang)本區域，室溫(wen)平衡5 min。

（3）用1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至(zhi)終濃(nong)度20 U/mL的工作(zuo)液。

（4）棄去Buffer，加入(ru)100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室(shi)溫孵育10 min。

（5）棄去DNase I工作液，PBS清洗(xi)2次。

（6）轉步驟2. TUNEL 反(fan)應(ying)。

2. TUNEL 反應(ying)

配制(zhi)TUNEL反(fan)應液(ye)（即(ji)用即(ji)配）：

對于貼壁細胞(bao)、細胞(bao)涂片或(huo)組織切片

（1）每(mei)個樣本加入50 μL TUNEL反應液，使反應液均勻覆蓋(gai)樣本。37℃避光孵育適宜(yi)的(de)時間(jian)（細(xi)胞推(tui)(tui)薦染(ran)色時間(jian)30min-1h，組織染(ran)色時間(jian)推(tui)(tui)薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)(fan)應(ying)液適(shi)合涂(tu)片(pian)(pian)、切片(pian)(pian)或96孔板(ban)(ban)(ban)（其他不同(tong)孔板(ban)(ban)(ban)可(ke)以適(shi)當調(diao)整TUNEL反(fan)(fan)應(ying)液體積，覆蓋細胞即(ji)可(ke)）。如果待檢(jian)測的樣品(pin)為涂(tu)片(pian)(pian)、切片(pian)(pian)或在24孔板(ban)(ban)(ban)、12孔板(ban)(ban)(ban)或6孔板(ban)(ban)(ban)中，可(ke)以使用防蒸發膜，或自(zi)行(xing)嘗試(shi)使用自(zi)封(feng)袋或者(zhe)其它適(shi)當材(cai)料自(zi)行(xing)裁剪成比孔略小的圓形塑料片(pian)(pian)，滴(di)加TUNEL反(fan)(fan)應(ying)液后覆蓋在樣品(pin)上(shang)，可(ke)以防止(zhi)TUNEL反(fan)(fan)應(ying)液蒸發，并(bing)且使TUNEL反(fan)(fan)應(ying)液均勻覆蓋樣本。

（2）棄去TUNEL 反應液，PBS漂洗(xi)2次，每次5 min。【注】：為了降(jiang)低背景，PBS漂洗切片(pian)1次后，可(ke)再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中(zhong)含5 mg/mL BSA）漂洗3次，每次 5 min，這(zhe)樣游離的未反應的標記物可(ke)以清除較干凈。

（3）（可選）每(mei)個樣本加入適量濃(nong)度為5 μg/mL 的DAPI染(ran)液(ye)，室溫避光(guang)孵育(yu)5 min。染(ran)色(se)完成后，棄去DAPI染(ran)液(ye)，PBS漂洗2次，每次5 min。

（4）（可選）切(qie)片封片：將切(qie)片依次在純水、70%乙醇(chun)、80%乙醇(chun)、90%乙醇(chun)、95%乙醇(chun)、無水乙醇(chun)中(zhong)浸沒5 min，最后將(jiang)切(qie)片樣本置于染色缸(gang)中(zhong)以新鮮的二甲苯浸泡(pao)，透明化處(chu)理2次(ci)，每次(ci)5 min。脫水完(wan)成后，擦去(qu)切(qie)片周圍的液(ye)體(ti)，每個樣本滴加50 μL抗(kang)(kang)熒(ying)光淬滅(mie)封片劑（抗(kang)(kang)熒(ying)光淬滅(mie)封片劑可能會不適用于某(mou)些染料，實(shi)驗前建議進行預實(shi)驗測試匹配性），蓋上蓋玻(bo)片，用鑷子的鈍端輕(qing)輕(qing)敲擊蓋玻(bo)片，去(qu)除氣泡(pao)以使封片。

（5）用(yong)濾紙吸去多余的液體，向(xiang)樣本(ben)區域(yu)加100 μL PBS保持樣本濕潤，立(li)即在熒(ying)光顯(xian)微鏡下(xia)觀察。

對于懸(xuan)(xuan)浮細(xi)胞(bao)或細(xi)胞(bao)懸(xuan)(xuan)液

（1）每個(ge)樣本管加入50 μL TUNEL反應液輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)重懸細胞，37℃避光孵(fu)育30~60 min。每隔15 min用微量(liang)移液器輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)重懸細胞。

（2）2000 rpm 離心5 min，棄(qi)去(qu)TUNEL 反應液(ye)，加(jia)入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）輕(qing)輕(qing)重懸細胞，并清洗2次。

（3）每個(ge)樣本管加入100 μL濃(nong)度(du)為5 μg/mL的(de)DAPI染液，室溫避光孵育5 min。

（4）加(jia)入400 μL PBS重懸細胞，立即用流式細胞儀(yi)檢測或進行涂片后(hou)在熒光顯微鏡下觀察。

注意(yi)事(shi)項

1. 本產品僅限(xian)于科學(xue)實(shi)驗研究使(shi)用，不得用于臨床(chuang)診斷(duan)、治療等領域(yu)。

2. 使用前請將產(chan)品瞬時離心至管底，再進(jin)行后續實驗。

3. 染色(se)背(bei)景(jing)較重(zhong)或非特異性著色(se)明顯(xian)時可適當減(jian)少染色(se)時間(jian)。

4. 實驗時建(jian)議增加陰性(xing)對照和陽(yang)性(xing)對照組。

5. 組分A使用時請佩(pei)戴(dai)口罩、手套，如接(jie)觸(chu)皮膚，請立(li)即用大量水沖(chong)洗。

6. 熒(ying)光(guang)(guang)染料均存在淬滅問題，請(qing)盡(jin)量注意(yi)避光(guang)(guang)，以減緩熒(ying)光(guang)(guang)淬滅。

7. 為了您的安全和健康，請穿(chuan)實驗(yan)服并戴一(yi)次性手套操作。

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