EZ 488 TUNEL細胞凋亡(wang)檢測試劑盒（綠色熒(ying)光(guang)）

產(chan)品(pin)描述(shu)

細(xi)胞(bao)凋亡(wang)的一個顯著特點(dian)是(shi)細(xi)胞(bao)染色體 DNA 的(de)(de)降解，這(zhe)是(shi)一個較普(pu)遍的(de)(de)現象。這(zhe)種降解非(fei)常(chang)特異(yi)(yi)并(bing)有規律，所產生的(de)(de)不同(tong)長度的(de)(de) DNA 片段(duan)約為(wei) 180 bp-200 bp 的(de)(de)整數倍，表現為(wei)瓊脂(zhi)糖凝膠電泳中(zhong)呈現特異(yi)(yi)的(de)(de)梯(ti)狀 Ladder 圖(tu)譜，本試(shi)劑盒(he)采用(yong) TUNEL 法，應用(yong)末(mo)端(duan)脫(tuo)氧(yang)核糖核苷酸轉移(yi)酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋(diao)亡細胞(bao)斷(duan)裂(lie)DNA 的(de)(de)3′-OH末(mo)端(duan)催化摻入(ru)EZ 488-dUTP。EZ 488-dUTP標記的(de)(de) DNA 可以(yi)用(yong)熒光顯微鏡直接觀察或者用(yong)流(liu)式細胞(bao)儀定(ding)量。TUNEL 法可以(yi)選(xuan)擇性的(de)(de)檢測凋(diao)亡細胞(bao)，而非(fei)壞死細胞(bao)或因輻照和藥物治療而造成(cheng)的(de)(de) DNA 鏈斷(duan)裂(lie)的(de)(de)細胞(bao)。TUNEL 實驗(yan)中(zhong)， TdT 酶催化 dUTP 摻入(ru)斷(duan)裂(lie)的(de)(de) DNA 鏈的(de)(de)3′-OH末(mo)端(duan)。抗原標記的(de)(de) dUTP（如digoxin-dUTP、生*素-dUTP），因為(wei)它可以直接進(jin)行原位(wei)檢測，是一種(zhong)更(geng)快速、直接的檢測手(shou)段(duan)。

訂購(gou)信(xin)息(xi)

產品(pin)組分(fen)

運(yun)輸與保(bao)存

藍冰運輸。-20℃避光保存(cun)，有效期24個月。【注】：避免反復凍融。

實驗(yan)材料（自備）

PBS緩沖液（1×，pH~7.4）

0.2% Triton X-100（PBS配制）

0.1% Triton X-100（PBS配制(zhi)，其中含5 mg/mL BSA）

4%多聚*醛(quan)（PBS配制）

免疫組化筆(bi)

脫蠟(la)溶劑(ji)（石蠟(la)切片(pian)樣本）

石(shi)蠟切片處理相關試(shi)劑

抗熒光(guang)淬滅(mie)封片劑

ddH₂O

使(shi)用(yong)方法

一、實(shi)驗設計

1. 陽性(xing)對照（可選）：

　　DNase I處理制備陽性對照載玻(bo)片。DNase I可以消化(hua)單鏈(lian)或雙鏈(lian)DNA產生單脫氧核苷酸(suan)(suan)或單鏈(lian)或雙鏈(lian)的寡脫氧核苷酸(suan)(suan)的核酸(suan)(suan)內切酶，人為(wei)造(zao)成細(xi)胞凋亡。

2. 陰性對照（可選）：

　　使(shi)用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處理組(zu)。

4. 實(shi)驗對照組(zu)。

二、實(shi)驗步驟

1. 樣(yang)本準(zhun)備：

對(dui)于貼壁細(xi)胞或細(xi)胞涂片

（1）PBS清洗1次。【注】：如果(guo)擔心細(xi)(xi)胞涂片的細(xi)(xi)胞貼得不牢，可以(yi)干燥(zao)樣品使細(xi)(xi)胞貼得更牢。

（2）固定：加入適量4%多聚*醛（PBS配制(zhi)），室(shi)溫固定30 min。PBS清(qing)洗2次(ci)。

（3）通透：加(jia)入適量0.2% Triton X-100（PBS配制(zhi)），室溫(wen)通(tong)透20 min。PBS清洗2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應。

對于懸(xuan)(xuan)浮細(xi)胞或細(xi)胞懸(xuan)(xuan)液(ye)

（1）收集細胞（ 3-5×10⁶個細胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

（2）固定：加入適(shi)量4%多聚*醛（PBS配制）充(chong)分(fen)重懸細胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗(xi)2次。

（3）通(tong)透(tou)：加入適量(liang)0.2% Triton X-100（PBS配制），室(shi)溫(wen)通透20 min。2000 rpm離心(xin)5 min，PBS清(qing)洗2次。

（4）轉步驟2. TUNEL 反應。

石蠟組織(zhi)切片

（1）脫蠟與水化：將(jiang)切片樣(yang)本依次放入二(er)甲苯I（10 min）→ 二(er)甲苯II（10 min）→ 100％乙醇(chun)I（5 min）→ 100％乙醇(chun)II（5 min）→ 95%乙醇(chun)（5 min）→ 90%乙醇(chun)（5 min）→ 80%乙醇(chun)（5 min）→ 70%乙醇(chun)（5 min）→ ddH2O沖洗(xi)5 min，沖洗(xi)2次。【注】：二甲苯有毒(du)，易揮發，請在通風櫥(chu)中進行此操作(zuo)。

（2）用(yong)濾紙(zhi)吸干切片樣(yang)(yang)本(ben)周圍液體(ti)(ti)，用(yong)免疫組化筆(bi)圈好樣(yang)(yang)本(ben)輪廓(kuo)，以便下游通透與標記。

注：若在后(hou)續實驗(yan)操作中發現免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補(bu)畫。

（3）通透：按1: 100的(de)比例，將2 mg/mL的(de)Proteinase K溶液用PBS稀釋至(zhi)終濃度20 µg/mL，在每個樣本(ben)上滴(di)加100 µL，使(shi)溶液覆蓋全部樣本(ben)區(qu)域，20-37℃孵育(yu)20 min。【注】：Proteinase K可(ke)通透細胞(bao)膜(mo)和核膜(mo)，從而使后續(xu)步(bu)驟(zou)的(de)(de)(de)染色(se)試劑充分進(jin)入細胞(bao)核進(jin)行反應，提高(gao)標(biao)記效(xiao)率(lv)。孵育時間過(guo)長會增(zeng)加組織切片(pian)在后續(xu)洗滌步(bu)驟(zou)中從載波片(pian)上脫落(luo)的(de)(de)(de)風險，過(guo)短則可(ke)能(neng)造成透性(xing)處理不充分，影響標(biao)記效(xiao)率(lv)。為得到更好(hao)的(de)(de)(de)結果(guo)，Proteinase K的(de)(de)(de)濃度(du)、孵育時間、溫度(du)需根(gen)據不同類型組織樣(yang)本進(jin)行優化。

（4）PBS漂洗切(qie)片2次(ci)，每次(ci)5 min，用濾(lv)紙吸(xi)去多(duo)余的液體，將處理好的樣本放在濕(shi)盒中(zhong)保持濕(shi)潤。

注(zhu)：這一步必須(xu)把Proteinase K洗(xi)滌干(gan)凈，否則會嚴重干(gan)擾后續的標(biao)記反應(ying)。

（5）轉步驟2. TUNEL 反應。

冰凍組織切片

（1）固定：取出冰凍切(qie)片，并(bing)回溫至室溫。加入適量4%多聚*醛（PBS配(pei)制），室(shi)溫固(gu)定30 min。PBS漂洗2次，每次10 min。【注】：若是擔心甲(jia)醛(quan)清洗不干(gan)凈，影響最終染(ran)色(se)效果。可在(zai)甲(jia)醛(quan)固定完成后加入適量(liang)2 mg/mL 甘*酸清(qing)洗 10 min，中(zhong)和殘(can)留的固定液，再進行PBS清洗。

（2）用(yong)濾(lv)紙吸干切片(pian)樣本(ben)周圍液體，用(yong)免疫(yi)組化筆圈好樣本(ben)輪廓，以(yi)便下游通透與(yu)標記。

注：若在后續實驗操作中發現免疫組化筆(bi)畫的輪廓圈被破壞，需及時(shi)補畫。

（3）通透：按1: 100的(de)(de)比例，將2 mg/mL的(de)(de)Proteinase K溶液(ye)用PBS稀釋至(zhi)終濃度20 µg/mL，在每個(ge)樣本上滴加100 µL，使溶液(ye)覆(fu)蓋全部樣本區域，20-37℃孵(fu)育(yu)20 min。【注】：Proteinase K可通透細胞膜(mo)(mo)和核膜(mo)(mo)，從(cong)而使后續(xu)步驟的(de)染(ran)色試劑(ji)充分進入(ru)細胞核進行(xing)反應(ying)，提高標(biao)記(ji)效率。孵(fu)育(yu)時(shi)間過(guo)長會增加組織切(qie)片在后續(xu)洗(xi)滌(di)步驟中從(cong)載(zai)波片上脫落的(de)風險，過(guo)短則可能造成透性處理不充分，影響標(biao)記(ji)效率。為得到更(geng)好的(de)結果，Proteinase K的(de)濃度、孵(fu)育(yu)時(shi)間、溫度需(xu)根據不同類(lei)型組織樣本進行(xing)優(you)化(hua)。

（4）PBS漂洗(xi)切(qie)片2次，每次5 min，用濾紙吸去多余的(de)液體(ti)，將處理(li)好(hao)的(de)樣本放(fang)在(zai)濕盒中保(bao)持(chi)濕潤。【注(zhu)】：這一步必(bi)須把Proteinase K洗(xi)滌(di)干(gan)凈(jing)，否(fou)則會嚴(yan)重(zhong)干(gan)擾后(hou)續的標記反應(ying)。

（5）轉(zhuan)步驟2. TUNEL 反應。

陽(yang)性(xing)處理（僅(jin)陽(yang)性(xing)對照進(jin)行此步驟，其他(ta)樣品直接進(jin)行TUNEL反應步驟）

（1）按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀(xi)釋(shi)成(cheng)1× DNase I Buffer備用。

（2）滴(di)加(jia)100 µL 1× DNase I Buffer到(dao)已處理(li)的樣本(ben)上，覆(fu)蓋(gai)全部樣本(ben)區(qu)域，室溫(wen)平衡5 min。

（3）用(yong)1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終(zhong)濃度20 U/mL的(de)工(gong)作液。

（4）棄(qi)去Buffer，加入(ru)100 μL濃度為(wei)20 U/mL的 DNase I工作液，室(shi)溫孵(fu)育10 min。

（5）棄(qi)去DNase I工作液，PBS清洗2次(ci)。

（6）轉步驟2. TUNEL 反(fan)應。

2. TUNEL 反(fan)應

配制TUNEL反應液（即用即配）：

對于(yu)貼壁細(xi)胞、細(xi)胞涂片或(huo)組織切片

（1）每個樣本加入50 μL TUNEL反(fan)應液，使(shi)反(fan)應液均(jun)勻覆蓋樣本(ben)。37℃避光孵育適宜的時間（細胞推(tui)薦染色時間30min-1h，組織染色時間推(tui)薦2h）。【注】：50 μL TUNEL反(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye)(ye)適合涂片、切(qie)片或(huo)96孔(kong)(kong)板（其(qi)他不同孔(kong)(kong)板可以適當調整TUNEL反(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye)(ye)體(ti)積，覆蓋細胞即可）。如(ru)果(guo)待檢測的樣(yang)品為涂片、切(qie)片或(huo)在24孔(kong)(kong)板、12孔(kong)(kong)板或(huo)6孔(kong)(kong)板中，可以使用(yong)防蒸(zheng)發膜，或(huo)自(zi)行(xing)嘗試使用(yong)自(zi)封袋(dai)或(huo)者其(qi)它(ta)適當材料(liao)自(zi)行(xing)裁剪成比孔(kong)(kong)略小的圓形(xing)塑(su)料(liao)片，滴加TUNEL反(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye)(ye)后覆蓋在樣(yang)品上，可以防止TUNEL反(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye)(ye)蒸(zheng)發，并且使TUNEL反(fan)(fan)(fan)應(ying)液(ye)(ye)均勻覆蓋樣(yang)本。

（2）棄(qi)去TUNEL 反(fan)應液，PBS漂洗2次，每次5 min。【注】：為(wei)了降低背景，PBS漂洗(xi)切(qie)片(pian)1次后，可再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）漂洗(xi)3次，每次 5 min，這樣游離的(de)未反應的(de)標記(ji)物(wu)可以(yi)清除較干(gan)凈。

（3）（可選(xuan)）每個樣本加入適量(liang)濃(nong)度為5 μg/mL 的DAPI染液(ye)，室(shi)溫避光孵(fu)育5 min。染色完成(cheng)后(hou)，棄去DAPI染液(ye)，PBS漂洗2次(ci)，每次(ci)5 min。

（4）（可選）切片(pian)封片(pian)：將切片(pian)依次(ci)在純水、70%乙醇(chun)、80%乙醇(chun)、90%乙醇(chun)、95%乙醇(chun)、無水乙醇(chun)中浸(jin)沒5 min，最(zui)后(hou)將切片(pian)(pian)樣本置于染(ran)色缸中以(yi)新(xin)鮮的二(er)甲苯浸(jin)泡，透明化處理2次，每(mei)次5 min。脫水完成后(hou)，擦(ca)去切片(pian)(pian)周圍的液體(ti)，每(mei)個(ge)樣本滴加50 μL抗(kang)熒(ying)光淬(cui)滅(mie)封片(pian)(pian)劑（抗(kang)熒(ying)光淬(cui)滅(mie)封片(pian)(pian)劑可能會不適用(yong)于某些染(ran)料，實驗前(qian)建議進(jin)行預實驗測試匹配(pei)性），蓋(gai)上蓋(gai)玻片(pian)(pian)，用(yong)鑷子(zi)的鈍端輕輕敲擊蓋(gai)玻片(pian)(pian)，去除氣泡以(yi)使封片(pian)(pian)。

（5）用濾紙吸去多余(yu)的液體，向樣本(ben)區域加100 μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯(xian)微鏡下觀(guan)察。

對于懸浮細胞或細胞懸液

（1）每個樣(yang)本管(guan)加入50 μL TUNEL反應液(ye)輕(qing)輕(qing)重(zhong)懸細胞，37℃避光孵育30~60 min。每隔15 min用微量(liang)移液(ye)器輕(qing)輕(qing)重(zhong)懸細胞。

（2）2000 rpm 離(li)心(xin)5 min，棄(qi)去TUNEL 反應液，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中(zhong)含5 mg/mL BSA）輕輕重懸細(xi)胞(bao)，并清洗2次。

（3）每個樣本(ben)管加(jia)入(ru)100 μL濃(nong)度(du)為5 μg/mL的DAPI染(ran)液，室(shi)溫避光(guang)孵育5 min。

（4）加(jia)入(ru)400 μL PBS重(zhong)懸細胞，立即用流式細胞儀檢測或(huo)進行涂片后在熒光顯微鏡下(xia)觀察。

注意事項

1. 本產品(pin)僅限于(yu)科學(xue)實驗研究使用(yong)，不得用(yong)于(yu)臨床(chuang)診斷(duan)、治療(liao)等領域。

2. 使用前請將產品(pin)瞬時(shi)離心至管底，再進(jin)行(xing)后續實(shi)驗。

3. 染色(se)背景較(jiao)重或(huo)非特異性著色(se)明顯時可適當減少染色(se)時間。

4. 實驗時(shi)建議增(zeng)加陰性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)和陽性(xing)對(dui)(dui)照(zhao)組(zu)。

5. 組(zu)分A使用時請佩戴口罩、手(shou)套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖(chong)洗。

6. 熒(ying)光染料(liao)均(jun)存在淬(cui)滅問題，請(qing)盡量注(zhu)意(yi)避光，以減緩熒(ying)光淬(cui)滅。

7. 為了(le)您的安(an)全和健康(kang)，請穿實驗服并戴一次性手(shou)套操作(zuo)。

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